ARAUJO, Arthur Soares de. Modelagem estrutural e análises in silico e in vitro da catepsina b de Trypanosoma cruzi. 2021. 137 f., il. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2021.
Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2021.
Resumo Portugues
A doença de Chagas tem como agente etiológico o parasito intracelular obrigatório Trypanosoma cruzi e acomete aproximadamente 7 milhões de pessoas no mundo sendo endêmica em países da América Latina. A doença caracteriza-se ainda como negligenciada por não possuir tratamento eficaz para os casos durante a fase crônica, bem como cura e por afetar, em sua maioria, a população de baixa renda. Em vista disso, é necessária a descoberta de fármacos mais eficazes e seguros com novos mecanismos de ação. Nesse contexto, a catepsina B destaca-se como uma císteíno protease essencial em outros organismos pela sua atuação no processo infeccioso. Embora já tenha sua atividade enzimática estudada, abordagens de estrutura e função da catepsina B de T. cruzi (CatBTc) não haviam ainda sido exploradas. Este trabalho, portanto, teve como objetivo a elucidação das funções da catepsina B de T. cruzi por meio de análises in silico e in vitro. Dessa forma, desenvolvemos e avaliamos modelos tridimensionais da CatBTc. A partir do melhor modelo obtido, realizamos uma triagem virtual da biblioteca de compostos do Museu Nacional de História Natural de Paris, por meio de cálculos de docking molecular e outras abordagens computacionais para priorizar compostos potenciais inibidores de CatBTc para posterior validação in vitro. Por fim, a obtenção da proteína recombinante expressa em E. coli e do nocaute duplo dos alelos presentes nas cepas CL Brener e Y utilizando o sistema CRISPR/Cas9 foram explorados com a finalidade de realizar a sua análise funcional. Assim, foi possível se obter dois modelos tridimensionais computacionais da protease provenientes de servidores diferentes que foram submetidos a cálculos de docking com a seleção 19 compostos promissores. A proteína recombinante foi expressa e purificada nas frações solúvel e insolúvel com sucesso, contudo, não apresentou atividade. A primeira tentativa de nocaute gênico resultou na morte e dificuldade de seleção de parasitos mutantes possivelmente devido importância do gene para a sobrevivência do parasito.
Resumo Ingles
Chagas Disease is caused by the obligate intracellular parasite Trypanosoma cruzi and affects approximately 7 million people worldwide. It is considered a neglected tropical disease (NTD) for mostly infect low-income population from Latin American countries and not having effective and safe treatment for the most severe cases. Therefore, new therapeutic alternatives are required. In this sense, proteases stand out as potential molecular targets of drugs for acting in essential biological processes. Among them, the cysteine protease, cathepsin B sticks out in other organisms for its role in infectious process. Although its enzymatic activity has already been studied, structural and functional approaches of cathepsin B T. cruzi have not been explored yet. Hence, this work, aimed to enlighten the performance and functions of cathepsin B of T. cruzi through in silico and in vitro analyses. In this way, we developed and evaluated three-dimensional CatbTc models. From the best obtained 3D model, we performed a virtual screening of the compound library of the Muséum National d'Histoire Naturelle de Paris (MNHN), through molecular docking calculations and other computational approaches to prioritize potential CatbTc inhibitor compounds for further in vitro validation. Ultimately, we attempted to obtain the recombinant protein expressed in E. coli and the double knockout of the alleles present in the strains CL Brener and Y using the CRISPR/Cas9 system aspiring to perform its functional analysis. Thus, it was possible to obtain two 3D models of the protease from distinct servers that were submitted to docking calculations, finally selecting 19 promising compounds. The recombinant protein was successfully expressed and purified in soluble and insoluble fractions, however, it displayed no activity. The first gene knockout attempt resulted in the death and difficulty of selecting mutant parasites, which was likely due to the relevance of the gene for the parasite’s survival.
Unidade academica
Faculdade de Medicina (FM)
Programa de Pos-Graduacao
Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular
Idioma
por
Tipo de documento
Dissertação
Formato
application/pdf
Direitos de acesso
Acesso Aberto
Palavras-chave
Doença de Chagas||Proteases||Catepsina B||Docking molecular||Modelagem estrutural
