Sistemática molecular para ácaros planos do gênero Brevipalpus Donnadieu (Acari: Tenuipalpidae) : utilização de marcadores moleculares mitocondriais e nucleares

Resumo Portugues

O gênero Brevipalpus Donnadieu destaca-se como um dos mais importantes na família Tenuipalpidae. Esses ácaros fitófagos podem causar danos a seus hospedeiros, sejam diretos, pela alimentação em folhas, ramos e frutos, sejam indiretos, devido à transmissão de vírus. A taxonomia dos ácaros Brevipalpus, especialmente das espécies de importância econômica, tem representado um desafio para os acarologistas; numerosas sinonímias têm sido estabelecidas e a ocorrência de espécies crípticas tem sido confirmada. A acurada identificação desses ácaros é fundamental para compreensão do papel de cada espécie na transmissão dos fitovírus, para a determinação dos hospedeiros de cada espécie, e para a definição de medidas de prevenção e controle. Estudos morfológicos com a utilização de diferentes técnicas de microscopia têm possibilitado um imenso avanço na taxonomia do grupo. Em uma abordagem integrativa, além dos estudos morfológicos é fundamental dispor de ferramentas adicionais para a construção de uma sistemática consistente dos grupos de organismos. Até o momento apenas um fragmento, da região Citocromo Oxidase I (COI) do DNA mitocondrial foi explorado na sistemática de Brevipalpus. A utilização de um maior número de marcadores moleculares, independentes, é importante para a consistência dos estudos. O presente trabalho teve como objetivos contribuir para o avanço da sistemática molecular de ácaros Brevipalpus, através da avaliação e otimização de protocolos de extração e amplificação de DNA; comparação de filogenias obtidas a partir de sequências de quatro regiões do genoma, incluindo marcadores mitocondriais - dois fragmentos da região COI -, e nucleares - regiões “Internal Transcriber Spacer II” (ITS2) e subunidade D1-D3 do gene 28S; apresentação de faixas de distâncias genéticas intra e interespecíficas; e avaliação de caracteres morfológicos em um contexto filogenético. Foram obtidas 25 amostras de Brevipalpus, de cinco países - Argentina, Brasil, Chile, Espanha, e Israel -, de 22 plantas hospedeiras. Foram avaliados dois protocolos de extração de DNA em relação ao rendimento da concentração de DNA, de sua qualidade e eficiência para amplificação, sendo um parcialmente destrutivo e um não destrutivo. Apesar do rendimento da concentração de DNA dos dois protocolos ser similar, observou-se maior eficiência de amplificação com o DNA obtido através do método parcialmente destrutivo. Para cada um dos quatro pares de primers foram testadas Reações de Polimerase em Cadeia (PCR) com variações nas concentrações de componentes da reação (MgCl2, BSA, DNTP e primers), assim como nas condições das reações (temperaturas de amplificação, número e tempo dos ciclos). As reações de PCR foram alteradas para possibilitar a amplificação do DNA com apenas 2μL de DNA molde, permitindo a amplificação dos quatro marcadores com DNA de um único espécime. Para as análises filogenéticas, além das sequências obtidas durante o desenvolvimento desse estudo, foram incluídas, nos datasets das análises filogenéticas, sequências de Brevipalpus recuperadas do GenBank. O fragmento da região COI amplificado com os primers DNR e DNF foi de 373 pares de base (pb) e o alinhamento final foi composto por 190 sequências de Brevipalpus (92 obtidas nesse estudo, 98 recuperadas do GenBank), as quais foram classificadas em 89 haplótipos, agrupados em 18 linhagens. O fragmento da região COI amplificado com os primers LCO e HCO foi de 650pb e o alinhamento final foi composto por 64 sequências (todas obtidas nesse estudo), as quais foram classificadas em 31 haplótipos, agrupados em 12 linhagens. O fragmento da região ITS2 foi de 500pb e o alinhamento final foi composto por 109 sequências (108 obtidas nesse estudo, uma recuperada do GenBank), as quais foram classificadas em 43 genótipos, agrupados em 14 linhagens. O fragmento da região D1-D3 foi de 900pb e o alinhamento final foi composto por 74 sequências (todas obtidas nesse estudo), as quais foram classificadas em 28 genótipos, agrupados em 11 linhagens. De forma geral, as topologias das árvores filogenéticas obtidas a partir de sequências das quatro regiões do genoma foram congruentes. Apesar de não ter sido possível obter sequências dos quatro fragmentos para todos os espécimes foi possível fazer a correspondência entre os clados das diferentes árvores a partir das infomações sobre as amostras e/ou espécimes sequenciados. Entretanto, entre as árvores dos diferentes marcadores, foram observadas algumas incongruências na divisão de linhagens dentro dos grupos phoenicis e obovatus. A principal diferença na topologia das ávores filogenéticas, foi a posição do clado do grupo cuneatus. O status taxonômico de algumas populações, que provavelmente consituem novos táxons para a ciência, foi aclarado. Os resultados das análises filogenéticas indicaram a necessidade da condução de estudos mais detalhados para esclarecer a posição taxonômica de linhagens próximas a B. yothersi, B. incognitus e B. phoenicis tipo 1, para as quais não houve consenso entre as filogenias das diferentes regiões. O valor filogenético de alguns dos caracteres morfológicos que têm sido utilizados para a taxonomia de Brevipalpus foi discutido com a finalidade de subsidiar a revisão da classificação de grupos. As informações geradas representam um ponto de partida para a construção de uma classificação taxonômica consistente para os ácaros Brevipalpus, baseada nas relações filogenéticas entre os táxons. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT