Silenciamento da expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) em linhagem de neuroblastoma via siRNAs sintéticos em dupla fita
Autor(a)
Pereira, Linus de Queiroz
Orientador(a) Coorientador(a)
Almeida, Ricardo Titze de
Data de aceite
2016-07-03
Data de disponibilizacao
2016-07-03
Data de publicacao
2016-07-03
Data de defesa submissao
2011-07
Citacao
PEREIRA, Linus de Queiroz. Silenciamento da expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) em linhagem de neuroblastoma via siRNAs sintéticos em dupla fita. 2011. 66 f., il. Dissertação (Mestrado em Saúde Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2011.
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2011.
Resumo Portugues
O óxido nítrico (NO) é formado pelas enzimas NO sintases e desempenha papel na patogênese da neurodegeneração. NO sintase neuronais são expressas em áreas cerebrais lesionadas e sua inibição reduz efeitos de agentes neurotóxicos. O atual estudo desenvolveu siRNAs (small interfering RNAs) direcionados a duas sequências do RNAm de nNOS, presentes nos exons 2 e 28. Primeiramente, foi utilizado o algoritmo Biopredsi para identificar alvos de RNAi. Foi realizada síntese química dos siRNA duplos com 21 nucleotídeos - exon2_hnNOS e exon28hnNOS (Qiagen). Células de neuroblastomas SH-SY5Y receberam 150 pmol ou 300 pmol de cada siRNA estruturado em lipossomas (Lipofectamine 2000®, Invitrogen). Utilizou-se o controle negativo scramble All-Stars® (Qiagen). Os meios de cultivo celular utilizados foram Optimen® e DMEM® (Gibco), pelas primeiras 6h e para as 24h de incubação restantes, respectivamente. O conteúdo de RNAm de nNOS foi quantificado por PCR em tempo real via SYBR Green®; os efeitos de silenciamento foram apresentados pela expressão relativa (2-ΔΔCT). O nível de RNAm foi reduzido para até 60% do controle; os efeitos de silenciamento variaram de acordo com os alvos e doses. Os efeitos dos siRNA sobre a apoptose por neomicina foram determinados pelo ensaio de MTT. As células foram lesionadas por neomicina e tratadas com um dos siRNAs (exon2_hnNOS, exon28hnNOS ou scramble) por dois tempos distintos: imediatamente após ou 24h após a lesão. Ambas estruturas de siRNA mostraram efeitos antiapoptóticos, que alcançaram o máximo de 28,7%. Os efeitos variaram de acordo com o siRNA e o tempo de tratamento. Exon2_hnNOS produziu o maior efeito quando o tratamento foi realizado logo após lesão; exon28_hnNOS foi mais efetivo 24h após a lesão. Os resultados do atual estudo mostram a utilidade de siRNAs no entendimento da patogenia de doenças neurológicas e abrem novos caminhos para a terapia gênica de doenças neurodegenerativas.
Resumo Ingles
Nitric oxide (NO) is formed by the NO synthase enzymes and play pivotal roles in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neuronal NO synthase enzyme (nNOS) is expressed in brain areas submitted to injury, and its pharmacological blocking can decrease the effects of neurotoxic agents. In our study, we developed and tested two siRNAs targeted to two different nNOS mRNA sequences, located in the exons 2 and 28. Firstly, we used the Biopredsi algorithm to identify the RNAi targets. The synthetic siRNA duplexes with 21 nucleotides (exon2_hnNOS and exon28_hnNOS) were synthetized by Qiagen. Neuroblastoma cells SH-SY5Y received 150 pmol or 300 pmol of each siRNA mixed with Lipofectamine 2000® (Invitrogen). The negative control was the commercial scramble All-Stars® (Qiagen). The cell culture media used in this study were Optimen® and DMEM® (Gibco), for the first 6h and for the remaining 24h of incubation, respectively. The mRNA content was quantified by reverse transcription real-time PCR with SYBR Green® and the silencing effects on nNOS expressed by the relative expression (2-ΔΔCT). The nNOS mRNA content was reduced to 60% to the control level; the silencing effects varied according to the targets and doses used. To determine the effects of siRNA on the apoptotic phenotype, we used the MTT assay. Cells were lesioned by neomycin and treated with each of the siRNAs (exon2_hnNOS, exon28_hnNOS, or scramble) at two time-points: immediately after – or 24h after lesion. Both siRNA structures showed anti-apoptotic effects that reached 28.7%. The effects varied according to the siRNA used and the treatment time-point. Exon2_hnNOS produced the highest effect when the treatment began immediately after lesion; exon28_hnNOS was more effective 24h after lesion. Our results encourage the use of siRNAs to study the role of nNOS in the pathogenesis of brain diseases and highlighted a new therapeutic aproach for neurodegenerative diseases.
Unidade academica
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
Programa de Pos-Graduacao
Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal
Idioma
Português
Tipo de documento
Dissertação
Formato
application/pdf
Direitos de acesso
Acesso Aberto
Termo de licenca
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