Etude des événements moléculaires de la gamétogenèse de Plasmodium berghei par des approches protéomiques

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fra: Dans l'histoire de la médecine, le paludisme est l'une des maladies parasitaires les plus graves et répandues. Elle est causée par des parasites du genre Plasmodium. Les parasites du paludisme de rongeurs sont couramment utilisés comme modèles pour étudier le paludisme humain permettant des études de génétique inverse in vivo. Bien que la gamétogenèse des stades sexués de Plasmodium soit une étape essentielle pour la transmission du paludisme, les données moléculaires sur la réorganisation nucléaire, l'assemblage du flagelle et de leurs régulations pendant la gamétogenèse, sont toujours incomplètes. La kinésine-8 de P. berghei est une protéine motrice qui jouerait un rôle important lors de la formation des gamètes mâles. Les gamétocytes avec le gène kin8 interrompu (Δkin8) sont morphologiquement semblables au type sauvage (WT) mais la gametogenèse mâle n’est pas fonctionnelle et les cellules mutantes sont incapables de produire des gamètes mâles. Afin d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires mis en oeuvre au cours de la gamétogenese, nous avons entrepris des études protéomiques et phosphoprotéomiques comparatives et quantitatives chez le parasite de type sauvage et chez le mutant Δkin8. Les gamétocytes enrichis à partir du sang de souris infectées ont été récoltés au temps 0, 7 et 15 min après induction de la gamétogenese par l'acide xanthurénique. Des comparaisons quantitatives relatives ont été effectuées par nanoLC/MS-MS du type Orbitrap Elite à partir des peptides et phosphopeptides préalablement enrichis par TiO2, marqués par iTRAQ, et de triplicats biologiques. Les données ont été traitées par les logiciels Patternlab for Proteomics et Blast2GO. Chez WT, 443 protéines et 206 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 2.617 peptides. Chez Δkin8, 530 protéines et 218 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 3.198 peptides. La formation de gamètes est fortement régulée par phosphorylation dans les deux conditions cellulaires. Parmi les processus biologiques (GO term), ceux liés à la traduction de l’ARN, la biosynthèse de l’ADN et de protéines sont les plus marquants et les plus régulés. La glycolyse et la réponse aux stress environnementaux sont également prédominantes, surtout au début de la différenciation des gamètes. Chez Δkin8, une forte sous-expression des protéines motrices kinésine-13 et dynéine, et une surexpression de protéines de l'organisation des bras intérieur et radiaire des axonèmes sont observées. La modulation de l’expression de ces protéines participe certainement, en plus de l’absence de la kinésine-8, au phénotype observé chez Δkin8: l’absence d’assemblage des axonèmes des gamètes mâles. Nous avons constaté également une sous-expression significative d’unités des nucléosomes et la surexpression de protéines impliquées dans la réplication. Ceci pourrait être relié à la perturbation de la division nucléaire observée chez Δkin8. Par rapport au WT, Δkin8 montre une expression élevée de protéines du complexe de protéasome dépendant de l’ubiquitine et de protéines impliquées dans la réponse au stress et le repliement des protéines, ainsi qu’une faible expression de certaines protéines qui interviennent dans le métabolisme énergétique et la sortie de l’hématie. Ces approches de protéomique et phosphoprotéomique comparatives permettent pour la première fois d’identifier les évènements moléculaires, leur dynamique et leur modulation, mis en jeux lors de la gamétogenèse de P. berghei.||Na história da medicina, a malária é uma das doenças parasitárias mais graves e distribuídas que afetam seres humanos. A doença é causada por parasitas do gênero Plasmodium. A malária de roedores é utilizada comumente como modelo por permitir a combinação de experimentos in vivo e in vitro, além de estudos por genética reversa. Embora a gametogênese dos estágios sexuais de Plasmodium seja um passo essencial da transmissão da malária, dados moleculares sobre a reorganização nuclear, montagem do flagelo e sua regulação na gametogênese estão incompletas. A ATPase cinesina-8 de P. berghei é uma proteína motora sugerida como um importante componente para a gametogênese macho. Os gametócitos com o gene kin8 interrompido (Δkin8) são semelhantes morfologicamente aos tipos selvagens (WT), enquanto que na gametogênese existe disfunção que tornam as células Δkin8 incompetentes para gametogênese completa e incapazes de exflagelar. Nos esforços para melhorar o conhecimento sobre a exflagelação de gametas, fizemos experimentos quantitativos de proteômica e fosfoproteômica com gametócitos WT e Δkin8. A amostra enriquecida de gametócitos do sangue murinho no tempo T0 foi induzida a exflagelação por ácido xanturênico e colhida no tempo T7 e T15 min. A quantificação relativa entre amostras foi realizada com uso de peptídeos marcados por iTRAQ na triplicata biológica independente e analisados por nanoLC/MS-MS Orbitrap Elite Mass Spectrometer após enriquecimento TiO2. Os dados foram processados através do softwares Patternlab for Proteomics e Blast2GO. Em parasitas WT, 443 proteínas e 206 fosfoproteínas foram identificados a partir de 2.617 peptídeos. Em parasitas Δkin8, 530 proteínas e 218 fosfoproteínas proteínas foram identificadas a partir de 3.198 peptídeos. A produção de gametas é regulada por fosforilações nas duas condições celulares. Entre os processos biológicos da Ontologia de Genes, aqueles relacionados a tradução de RNA, e biossíntese de DNA e proteínas foram as que mais se destacaram e mais regulados na gametogênese. Foi observado também que a glicólise e a resposta ao estresse ambiental foram mais notável principalmente no início da diferenciação celular. Para Δkin8, a desorganização de microtúbulos dos axonemas e fusos mitóticos é causa provável da supressão de proteínas motoras (cinesina -8, -13 e dineína) como também pela superexpressão de proteínas de organização do braço interno e braço radial. Observamos importante diminuição de unidades de nucleossomos e aumento de proteínas envolvidas com a desorganização da divisão nuclear. Quando comparado com o WT, no mutante houve maior expressão de proteínas envolvidas no complexo proteassoma dependente de ubiquitina e menor quantidade de algumas proteínas interferentes no metabolismo energético e egresso. A análise do Δkin8 traz novas informações sobre a exflagelação e mal funcionamento do microgameta mutante. Em conclusão, a gametogênese exige manifestamente a expressão de proteínas e sua regulação por fosforilações para a produção de energia na diferenciação dos gametas. A Cinesina 8 é essencial para a gametogênese masculina normal como também para a montagem de axonemas em P. berghei, e seu estudo fornece informações quanto a organização celular e biologia de Plasmodium.