Estudo evolutivo e bioquímico de serinoproteases da peçonha de toxicóferos

Resumo Portugues

As serinoproteases da peçonha de répteis do clado Toxicofera são toxinas que atuam no sistema hemostático da presa. Suas versões presentes em serpentes são extensivamente estudadas há décadas. Em contrapartida, pouco se conhece bioquimicamente as de lagartos. Apesar da sua elevada similaridade de sequências, essas enzimas atuam em uma ampla variedade de substratos, apresentando, entre outros, atividade semelhante à calicreína e à trombina. A evolução que resultou nessa diversificação pode ser estudada através da técnica de reconstrução de sequências ancestrais. Nesta abordagem, as sequências ancestrais são construídas a partir de sequências modernas, permitindo-nos compreender as propriedades das proteínas extintas. Este trabalho tem como objetivo estudar a evolução das serinoproteases de peçonha através da reconstrução da sequência ancestral de Viperidae e de sua caracterização, além da caracterização de uma serinoprotease da peçonha do lagarto Varanus komodoensis. A filogenia dessas enzimas assim como a sequência ancestral de Viperidae foram construídas utilizando-se o software MEGA-X. Ambas as enzimas foram expressas em Komagataella phaffii e purificadas por cromatografia de afinidade a Ni2+ . A deglicosilação das proteínas foi feita com a enzima PNGase F e os testes enzimáticos realizados utilizando-se ambas glicosiladas e desglicosiladas. A sequência reconstruída apresentou bons valores estatísticos. As enzimas expressas apresentaram tamanho diferente do esperado, o que foi confirmado como sendo causado por N-glicosilações, uma modificação pós-traducional prevalente nessas toxinas. Testes de atividade mostraram que a enzima ancestral apresenta atividade sobre o fibrinogênio apenas quando deglicosilada, enquanto a de V. komodoensis somente quando glicosilada. A clivagem do fibrinogênio não gerou formação de coágulos por nenhuma das enzimas, indicando que ambas atuam na depleção de fibrinogênio plasmático. A enzima ancestral mostrou atividade sobre um substrato sintético de calicreína tanto glicosilada como deglicosilada, o que endossa a ideia de que a calicreína é o ancestral das serinoproteases da peçonha. Além disso, a ancestral demonstrou possuir estabilidade estrutural, não sendo desnaturada até 95°C. Esse estudo foi capaz de ampliar o conhecimento da diversidade e da evolução funcional e estrutural dessas toxinas de toxicóferos.