Análise estrutural dos promotores dos genes de endoglicanase egl1 e egl4 de Humicola grisea var. thermoidea

Resumo Portugues

A limitação de recursos fósseis e o contínuo crescimento econômico tem aumentado a demanda por fontes alternativas para a produção de biocombustíveis e compostos químicos. A conversão da biomassa vegetal apresenta grande potencial para esse fim, já que representa a maior fonte renovável do planeta. O fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea (Hgvt) é conhecido por produzir uma ampla variedade de enzimas hidrolíticas termoestáveis. Dentre as hidrolases produzidas por esse organismo estão as celulases, xilanases, glicoamilases e trealases. Tais enzimas possuem grande potencial biotecnológico para a conversão de resíduos agroindustriais em produtos de maior valor agregado tais como ração animal, adubo, biocombustíveis, além de extração de óleos vegetais, processamento têxtil, branqueamento e reciclagem de papéis. A caracterização e a compreensão dos mecanismos regulatórios dos genes que codificam enzimas hidrolíticas são de grande importância para o aprimoramento de estratégias de produção dessas enzimas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo a análise estrutural das regiões 5´ não codificadoras a montante dos genes de endoglicanase 1 (egl1), endoglicanase 4 (egl4) e celobiohidrolase 1.1 (cbh1.1) de Hgvt. As regiões 5´UP foram amplificadas a partir de DNA genômico de Hgvt e clonadas no vetor pGOX, contendo marca de resistência à higromicina B e o cassete de expressão do gene de glicose oxidase (goxA) de Aspergillus niger como repórter visando a posterior caracterização funcional em sistema heterólogo de Aspergillus nidulans. As regiões promotoras de egl1 e egl4 foram inicialmente analisadas in silico quanto à presença de sítios de ligação para os fatores transcricionais PacC, regulador da expressão gênica em resposta ao pH, e CreA, mediador da repressão transcricional por glicose. A fim de se avaliar a interação desses fatores com os promotores foram sintetizadas sondas contendo sítios de ligação para CreA e para PacC. Os domínios de ligação de PacC e CreA foram produzidos em Escherichia coli como proteínas de fusão à glutationa-S-transferase (GST). As proteínas recombinantes e as sondas foram empregadas em ensaios de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA). Foi observada a formação de complexos específicos entre DNA e proteína em dois sítios para PacC e em dois sítios para CreA presentes na região promotora de egl1, o que aponta para a participação desses fatores na regulação do gene. Com relação ao gene egl4, não foi observada a interação entre o fator transcricional PacC e a região promotora do gene. Entretanto, houve formação de complexos entre CreA e os sítios presentes na região 5’UP de egl4. Apesar de reconhecerem os sítios consenso na região desse gene, nenhuma das interações mostrou ser específica. Tais dados sugerem que a regulação da expressão de egl4 obedeça a mecanismos distintos aos dos demais genes de celulase de Hgvt estudados até o momento. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT